9251細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則是對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的內(nèi)容及應(yīng)用做進(jìn)一步的說(shuō)明，

1.細(xì)菌內(nèi)毒素限值的設(shè)定

產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值一般是通過(guò)公式L=K/M計(jì)算得到的。其中M為人用每千克體重每小時(shí)最大供試品劑量,可參考藥品說(shuō)明書(shū)或具有權(quán)威性資料的用法用量。

制定品種細(xì)菌內(nèi)毒素限值時(shí)，應(yīng)考慮以下情況。

(1)聯(lián)合用藥應(yīng)考慮慧他制劑可能引入的細(xì)菌內(nèi)毒素;兒科用藥、營(yíng)養(yǎng)不良用藥和惡病質(zhì)用藥等,應(yīng)考慮細(xì)前內(nèi)毒毒對(duì)體弱患者人群可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的影響。因此，制定上述品種細(xì)菌內(nèi)毒素限值時(shí)，可在計(jì)算值的基礎(chǔ)上適當(dāng)嚴(yán)格。

(2)100ml及以上裝量的大輸液類(lèi)制劑，其細(xì)菌內(nèi)毒素限值一般不得超過(guò)0.50EU/ml。

(3)制定具有多種規(guī)格注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值時(shí),限值的單位應(yīng)與產(chǎn)品臨床用法用量(M)的標(biāo)示單位一致,如EU/mg、EU/或EU/ml。

(4)制定原料藥的細(xì)菌內(nèi)毒素限值時(shí)，應(yīng)參考其制劑的細(xì)菌內(nèi)毒素限值。

2.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的選擇

細(xì)菌內(nèi)毒素檢育法(通則1143)包括凝膠法和光度法共6種細(xì)菌內(nèi)毒素檢査方法。供試品檢測(cè)時(shí)可以選用其中任何一種方法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

（1）凝膠法 凝膠法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，供試品在排除干擾作用后均可使用凝膠法進(jìn)行檢驗(yàn)。凝膠法的干擾試驗(yàn)是確定供試品能否使用凝膠法的決定因素。進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)挑選與堂試劑反應(yīng)呈陰性的樣品進(jìn)行若樣品稀釋到MVD仍不能排除干擾作用，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)供試品的前處理進(jìn)行研究，再用干擾試驗(yàn)驗(yàn)證能否使用凝膠法。

（2）光度法 光度法(包括濁度法和顯色法)可定量檢測(cè)內(nèi)毒素的含量,能較為準(zhǔn)確評(píng)估產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程中污染的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn),定量檢測(cè)的數(shù)據(jù)不僅有利于追蹤產(chǎn)品質(zhì)量趨勢(shì)，還能起到風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警的作用，達(dá)到數(shù)據(jù)完整性的要求。

供試品能否采用光度法進(jìn)行檢測(cè)，須通過(guò)干擾試驗(yàn)確定。光度測(cè)定法可通過(guò)回收率判斷出干擾的趨勢(shì)，尤其對(duì)于研究性質(zhì)的樣品(如新產(chǎn)品)更具有優(yōu)勢(shì)。

由于光度法的檢測(cè)范圍比凝膠法寬，使得有干擾的樣品可以有更大的稀釋倍數(shù)，對(duì)于部分使用凝膠法無(wú)法排除干擾的樣品，可以嘗試使用光度法建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法。

3.供試品的前處理方法

除另有規(guī)定外，一般應(yīng)使用內(nèi)毒素檢查用水溶解樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

在水中溶解度低的樣品可以采取超聲波、加熱助溶、添加助溶劑、調(diào)節(jié)pH等方法提高其溶解度。當(dāng)采用適宜的有機(jī)溶劑(乙醇、DMSO等)進(jìn)行溶解時(shí)，必須進(jìn)行干擾試驗(yàn)驗(yàn)證內(nèi)毒素的回收。采用包合技術(shù)的新型制劑如微球、脂質(zhì)體等供試品，應(yīng)采取適官方法將包合體破壞，使包裹在內(nèi)部的細(xì)菌內(nèi)毒素完全釋放，再進(jìn)行檢測(cè)。

4.產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的建立

建立品種的細(xì)菌內(nèi)毒素檢査法時(shí)，為驗(yàn)證樣品和不同生產(chǎn)廠家鱟試劑反應(yīng)的一致性，應(yīng)使用兩個(gè)生產(chǎn)廠家的鱟試劑對(duì)至少三批樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)。建立產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素檢査法時(shí),若無(wú)法排除供試品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢査的干擾作用,或只能使用最高靈敏度鱟試劑(凝膠法為0.03EU/ml，光度法為0.001EU/m|)才能排除干擾，則該品種不宜建立細(xì)菌內(nèi)毒毒檢查項(xiàng).

5.其他

實(shí)驗(yàn)時(shí)，當(dāng)使用規(guī)格大于0.1ml/支裝量的鱟試劑時(shí)，為避免鱟試劑支間活性差異帶來(lái)的影響,應(yīng)將堂試劑復(fù)溶后混合，再分裝到反應(yīng)容器中使用。凝膠法常用的反應(yīng)容器為10mmx75mm的玻璃小試管或空安瓿等，光度法常用的反應(yīng)容器為測(cè)定儀專(zhuān)用試管或酶標(biāo)板。在凝膠法檢驗(yàn)時(shí)，如果計(jì)算出的MVD值不是整數(shù)，可以使用小于MVD的整數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，為判斷產(chǎn)品是否合格，需采用計(jì)算的MVD重新測(cè)試。

目前新的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法不斷出現(xiàn),以適應(yīng)特殊品種細(xì)菌內(nèi)毒素檢査的需要,或減少鱟試劑的使用量。如重組C因子法(見(jiàn)附)、微量凝膠法等當(dāng)采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢査法(通則1143)中未收載的方法檢測(cè)產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素時(shí),應(yīng)符合”凡例”的相關(guān)規(guī)定。

附:重組C因子法

(因子是鱟試劑中對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素敏感的蛋白,能夠選擇性識(shí)別內(nèi)毒素。重組C因子是一種人工合成的C因子，它被細(xì)菌內(nèi)毒素活化后,可與熒光底物作用產(chǎn)生與內(nèi)毒素濃度成比例的熒光信號(hào)。

本法系依據(jù)反應(yīng)混合物中的內(nèi)毒素濃度和其孵育終止時(shí)的熒光值之間存在量化關(guān)系來(lái)測(cè)定細(xì)菌內(nèi)毒素的含量，本法為終點(diǎn)熒光法。依據(jù)檢測(cè)原理，本法不存在G因子旁路干擾,具有較高的專(zhuān)屬性,因此適合于含有阝-葡聚糖干擾的樣品檢測(cè);本法所用試劑不含有B因子和凝固酶原、凝固蛋白原等,因此，含有對(duì)上述物質(zhì)抑制或增強(qiáng)作用的樣品適合使用重組C因子法。

重組C因子法試驗(yàn)需采用熒光酶標(biāo)儀,其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)等參數(shù)參照試劑的使用說(shuō)明書(shū),激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)一般為380nm/440nm，檢測(cè)溫度一般為37°C+1'C。

儀器靈敏度(增益值)調(diào)節(jié)、重組C因子試劑的配制方法、保溫時(shí)間等，參照所用儀器和試劑的有關(guān)說(shuō)明進(jìn)行。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)、干擾試驗(yàn)、檢查法以及結(jié)果判斷 參照細(xì)菌內(nèi)毒素檢育法(通則1143)中的方法2光度測(cè)定法。

來(lái)源：藥典委