本法系采用連續(xù)流動(dòng)注射技術(shù)和直流安培檢測(cè)器測(cè)定氰離子（CN-）含量（見附）。此法適用于還原胺化工藝制備的多糖蛋白結(jié)合疫苗中氰化物的含量測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)條件 氰化物連續(xù)流動(dòng)注射分析儀；進(jìn)樣體積為 200 μl；樣品周期時(shí)間為 160 秒；紫外波長(zhǎng)為 312 nm；直流安培檢測(cè)器。

 試液

（1）次磷酸硫酸溶液 取硫酸 55 ml，緩緩注入 500ml 水中，放冷，加次磷酸 20 ml，用水稀釋至 1000 ml，搖勻，得含 2%次磷酸的 1 mol/L 硫酸溶液。

（2）氫氧化鈉溶液 取澄清的氫氧化鈉飽和溶液 5.6 ml，加水使成 1000 ml，搖勻，即得0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液。

 對(duì)照品溶液 精密量取氰化物對(duì)照品 （水中氰成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或其他適宜的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）適量，用水定量稀釋制成每 1ml 約含氰離子（以 CN-計(jì)）500ng 的對(duì)照品貯備液。分別精密量取對(duì)照品貯備液適量，用水定量稀釋并分別制成每 1ml 中約含氰離子（以 CN-計(jì)1.25、2.5、5、10、40、80 ng 的溶液。

 靈敏度溶液 每 1ml 中約含氰離子（以 CN-計(jì)）1.25ng 的對(duì)照品溶液。

 供試品溶液 除另有規(guī)定外，取 3kD 超濾離心管，加水 1ml，以每分鐘 4000g離心 10 分鐘（采用水平轉(zhuǎn)頭）或每分鐘 7500g 離心 10 分鐘（采用固定轉(zhuǎn)頭），棄去水。精密量取供試品 2ml，置預(yù)先處理好的超濾離心管中，精密加氫氧化鈉溶液 1ml，以每分鐘 4000g 離心 45 分鐘（采用水平轉(zhuǎn)頭）或每分鐘 7500g 離心45 分鐘（采用固定轉(zhuǎn)頭），再精密加水 1 ml，自 “以每分鐘 4000g 離心 45 分鐘……”起，重復(fù)操作兩次，合并下層液體，用水定容至 5ml，搖勻。

適用性要求 靈敏度溶液圖譜中，主成分峰高的信噪比應(yīng)不小于 10；

以對(duì)照品溶液峰高對(duì)其相應(yīng)的氰離子濃度計(jì)算線性回歸方程，決定系數(shù)不低于 0.99。對(duì)照品溶液 （5 ng/ml）連續(xù)進(jìn)樣 5 次，所得峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）應(yīng)不大于 5%。 

測(cè)定法 將酸性試劑管路插入次磷酸硫酸溶液中，將堿性試劑管路插入氫氧化鈉溶液中，將載液管路插入水中。開啟蠕動(dòng)泵，讓溶液流經(jīng)整個(gè)系統(tǒng)，待基線平穩(wěn)后，分別取靈敏度溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液注入分析儀，記錄圖譜并測(cè)定氰離子峰高。

結(jié)果計(jì)算 以對(duì)照品溶液峰高對(duì)其相應(yīng)的氰離子濃度計(jì)算線性回歸方程，根據(jù)回歸方程計(jì)算供試品溶液中氰離子（以 CN-計(jì)）濃度 c（ng/ml），乘以 2.5，即為供試品中氰離子（以 CN-計(jì)）的濃度（ng/ml）。再除以多糖含量（mg/ml）即為供試品中氰化物殘留量（ng/mg）。

注意事項(xiàng)：

（1）本法僅適合測(cè)定 CN-，不適合 CN+和 OCN-。

（2）可根據(jù)供試品中氰化物含量調(diào)整對(duì)照品溶液濃度。

（3）供試品超濾完成后，膜上液體應(yīng)不大于 100 μL，若剩余較多，可延長(zhǎng)

超濾時(shí)間。

（4）必要時(shí)可先采用適宜溶劑稀釋供試品至適宜濃度，應(yīng)注意稀釋用溶劑中氰化物對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，必要時(shí)應(yīng)采用空白試驗(yàn)的方法對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行校正。

附氰化物連續(xù)流動(dòng)注射分析法

本法系通過(guò)對(duì)供試品進(jìn)行前處理（如超濾等），再使用連續(xù)流動(dòng)注射技術(shù)添加酸性試劑 1，在酸性條件下，樣品經(jīng)過(guò)紫外消解（312nm）把供試品中的氰化物轉(zhuǎn)化為氰離子（CN-），再添加酸性試劑 2，將氰離子轉(zhuǎn)換為氰化氫氣體，該氣體通過(guò)氣體擴(kuò)散膜擴(kuò)散至堿液后又轉(zhuǎn)化為氰離子（CN-），用直流安培檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。其中，氰離子（CN-）與銀/氯化銀的參考電極發(fā)生配位交換，產(chǎn)生的電流（即峰高）與氰離子濃度成正比，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法得到供試品中氰基的量。本法適用于供試品經(jīng)前處理可定量轉(zhuǎn)化為氰離子（CN-）的含量測(cè)定。 

1.對(duì)儀器的一般要求

連續(xù)流動(dòng)注射分析儀由蠕動(dòng)泵、紫外消解器、膜分離器、直流安培檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等組成。儀器示意圖如下：

（1）蠕動(dòng)泵：一種通過(guò)旋轉(zhuǎn)滾輪周期性擠壓彈性泵管，推動(dòng)管內(nèi)液體定向流動(dòng)的流體傳輸裝置。

（2）紫外消解器：內(nèi)置紫外燈（波長(zhǎng) 312nm）的在線消解裝置，通過(guò)紫外光解作用破壞氰化物絡(luò)合物的化學(xué)鍵，釋放游離氰離子。

（3）膜分離器：基于氣體擴(kuò)散原理的分離模塊，含疏水性微孔膜（如 PTFE膜），允許氣態(tài)氫氰酸透過(guò)，阻止液態(tài)干擾物進(jìn)入檢測(cè)系統(tǒng)。

（4）直流安培檢測(cè)器：基于電化學(xué)原理的檢測(cè)裝置，在恒定電位下測(cè)量氰離子在工作電極表面氧化/還原產(chǎn)生的電流信號(hào)。

（5）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：集成軟件和硬件的自動(dòng)化平臺(tái)，用于信號(hào)采集、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、濃度計(jì)算及結(jié)果輸出。

2.適用性要求 滿足品種項(xiàng)下規(guī)定的適用性要求。

3.數(shù)據(jù)處理

以測(cè)得的對(duì)照品溶液峰高對(duì)其相應(yīng)的氰離子濃度計(jì)算線性回歸方程，將供試品溶液峰高帶入線性回歸方程，求得供試品溶液中氰離子濃度。

4.注意事項(xiàng)

（1）不同品牌儀器試劑配制有所不同，可根據(jù)試劑情況進(jìn)行調(diào)整，按照 ICH《Q2（R2）：分析方法驗(yàn)證》指導(dǎo)原則的要求開展研究后使用。

（2）不同品牌儀器泵速有所不同，可適當(dāng)調(diào)整樣品周期時(shí)間（需滿足適用性要求）。

起草單位：四川省藥品檢驗(yàn)研究院 聯(lián)系電話：028-87877114

來(lái)源：藥典委

原文下載：通則0806氰化物檢查法（第四法）上網(wǎng)公示稿.pdf