人用基因治療制品總論

概述

人用基因治療制品通常由含有工程化基因構(gòu)建體的載體或遞送系統(tǒng)組成,其活性成分可為DNA、RNA、基因改造的病毒、細(xì)菌或細(xì)胞，通過(guò)將外源基因?qū)氚屑?xì)胞或組織，替代、補(bǔ)償、阻斷、修正特定基因，以達(dá)到治療疾病的目的。

依據(jù)載體的不同，可將人用基因治療制品分為以病毒為載體的人用基因治療制品，以質(zhì)粒DNA為載體的人用基因治療制品，以及以細(xì)菌為載體的人用基因治療制品等，其中以病毒和質(zhì)粒DNA為載體的人用基因治療制品為常見(jiàn)。

本總論是對(duì)人用基因治療制品生產(chǎn)和質(zhì)量控制的通用性技術(shù)要求,重點(diǎn)針對(duì)以病毒和質(zhì)粒DNA為載體的基因治療制品，用于基因修飾細(xì)胞(在輸入受試者或病人之前用基因治療載體進(jìn)行離體或體外修飾的自體或異體體細(xì)胞)的載體也適用于本總論，具體品種還應(yīng)結(jié)合制品本身的特性制定相關(guān)要求。

2 制造

2.1 基本要求

人用基因治療制品的制造主要包括生產(chǎn)用起始原材料、原材料和輔料的控制，載體的制備,目標(biāo)成分的提取、純化和制劑等過(guò)程。生產(chǎn)過(guò)程中使用的菌毒種和動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)應(yīng)符合"生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理及質(zhì)量控制"和”生物制品生產(chǎn)檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制”的相關(guān)要求。使用的原材料和輔料應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料質(zhì)量控制”的相關(guān)要求。應(yīng)采用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的生產(chǎn)工藝進(jìn)行生產(chǎn)，并對(duì)生產(chǎn)工藝全過(guò)程進(jìn)行控制。

2.2 載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

應(yīng)基于制品的臨床有效性和安全性進(jìn)行載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建。通?；诨蛑委熤破返淖饔脵C(jī)制,如通過(guò)編碼功能性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，或采用RNA干擾、小RNA或基因編輯等方式,采用基因沉默、外顯子跳躍、基因調(diào)控或基因敲除等方式修復(fù)、添加或刪除特定的基因序列，進(jìn)行載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建,

基因治療制品中使用的載體可以設(shè)計(jì)為靶向特定組織或細(xì)胞，或刪除與毒力、致病性或復(fù)制能力相關(guān)基因的病毒,以確保制品的安全性。

用于基因治療制品的常見(jiàn)的載體系統(tǒng)是病毒載體和質(zhì)粒DNA載體。病毒載體可分為非復(fù)制型、條件復(fù)制型或復(fù)制型，每種類型在設(shè)計(jì)時(shí)都應(yīng)針對(duì)安全件方面進(jìn)行特別考慮，采用非復(fù)制型載體要洗擇盡可能少產(chǎn)牛復(fù)制活件病毒或能夠有效避免輔助病毒風(fēng)險(xiǎn)的方法。質(zhì)村DNA載體應(yīng)考慮抗牛素抗件基因可能給病人帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)和危害，且不得使用氨芐西林抗性基因。

23起始原材料

用于基因治療制品生產(chǎn)的起始原材料主要包括生產(chǎn)用細(xì)胞、細(xì)菌或病毒種子。用于生產(chǎn)的細(xì)胞、細(xì)菌或病毒種子的來(lái)源和歷史應(yīng)清晰，應(yīng)建立至少兩級(jí)細(xì)胞庫(kù)和/或細(xì)菌/病毒種子批系統(tǒng)。

應(yīng)對(duì)所有起始原材料進(jìn)行充分鑒定并建立明確的質(zhì)量控制要求，確保無(wú)細(xì)菌、真菌、病毒和支原體等微生物污染。應(yīng)保證起始原材料的遺傳穩(wěn)定性并基于細(xì)胞庫(kù)/種子批經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)或多次傳代后產(chǎn)物的完整性和一致性，以及其表型和基因型特征等確定生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)/種子批的最高限度代次

以下是對(duì)生產(chǎn)用起始原材料質(zhì)量控制的一般要求，對(duì)不同的制品和生產(chǎn)工藝還需結(jié)合具體情況考慮,

病毒種子批231

病毒種子批質(zhì)控項(xiàng)目的確定應(yīng)根據(jù)種子批建立的特定情況以及病毒種子本身的相關(guān)特征，基于風(fēng)險(xiǎn)分析進(jìn)行評(píng)估。主種子批的質(zhì)控項(xiàng)目通常包括鑒別(基因擴(kuò)增、限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和免疫血清學(xué)檢測(cè)等)、病毒滴度，治療序列的轉(zhuǎn)錄/表達(dá)(如適用)、治療席列或表達(dá)產(chǎn)物的牛物活件(如適用)、無(wú)菌檢査(細(xì)菌和真菌)、支原體檢査、外源病毒因子檢査、復(fù)制型病毒(制品本身為復(fù)制缺陷型或條件復(fù)制型)等。主種子批確定無(wú)外源因子污染時(shí)，其工作種子批只需檢測(cè)該制備過(guò)程中可能引入的外源因子污染;如因主種子批數(shù)量限制而無(wú)法進(jìn)行全面的外源因子檢查時(shí)，應(yīng)對(duì)工作種子批進(jìn)行全面檢定。外源病毒因子應(yīng)符合"外源病毒因子檢査法”的相關(guān)要求,同時(shí)還應(yīng)對(duì)種子批歷史傳代過(guò)程中可能污染的特定外源病毒因子進(jìn)行檢測(cè)，除另有規(guī)定外，應(yīng)對(duì)病毒基因組的完整序列進(jìn)行分析，或至少應(yīng)確認(rèn)重要區(qū)域(如治療和調(diào)控元件,以及被人為修改的仟何區(qū)域及其側(cè)翼至少0.5kb內(nèi)的區(qū)域)的序列與理論預(yù)期相符、在特定情況下因基些位點(diǎn)產(chǎn)生突變?cè)斐尚蛄信c理論不符，應(yīng)得供不影響目的基因表達(dá)和制品質(zhì)量的證據(jù)。應(yīng)證明生產(chǎn)用病毒種子批的遺傳穩(wěn)定性、目的基因表達(dá)穩(wěn)定性和生產(chǎn)穩(wěn)定性，

2.3.2 生產(chǎn)/包裝細(xì)胞庫(kù)

生產(chǎn)/包裝細(xì)胞系進(jìn)行的檢測(cè)應(yīng)符合"生物制品生產(chǎn)檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制"的相關(guān)要求，通常包括鑒別及純度、基因分型/表型、遺傳穩(wěn)定性等，另外，在適用的情況下還應(yīng)檢測(cè)成瘤性/致癌性、引入序列的鑒別和完整性以及拷貝數(shù)等。

生產(chǎn)/包裝細(xì)胞庫(kù)內(nèi)、外源病毒因子檢査應(yīng)按本版藥典相關(guān)通則進(jìn)行。應(yīng)確定無(wú)細(xì)菌、真菌、支原體和螺原體(昆蟲細(xì)胞)等污染,

233細(xì)菌種子批

細(xì)菌種子批的質(zhì)控項(xiàng)目通常包括菌落形態(tài)、染色鏡檢、生化特性、抗生素抗性檢査、電鏡檢査、質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析等。應(yīng)確保不存在其他細(xì)菌、真菌和噬菌體的污染。應(yīng)檢測(cè)細(xì)菌種子批多次傳代后的基因型和表型的穩(wěn)定性。此外,對(duì)于基因修飾的細(xì)菌，其基因組重要區(qū)域(如引入的治療和調(diào)控元件，以及被人為改造的任何區(qū)域及其側(cè)翼至少0.5kb內(nèi)的區(qū)域)的序列應(yīng)與理論預(yù)期相符。在特定情況下因某些位點(diǎn)產(chǎn)生突變?cè)斐尚蛄信c理論不符時(shí)，應(yīng)提供不影響目的基因表達(dá)和制品質(zhì)量的證據(jù)。對(duì)于經(jīng)基因改造的質(zhì)粒不大于50kb的，應(yīng)進(jìn)行全序列測(cè)定。對(duì)于轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒的細(xì)菌種子批，應(yīng)檢測(cè)質(zhì)?？截悢?shù)和有/無(wú)質(zhì)粒細(xì)菌的比例。對(duì)于生產(chǎn)質(zhì)粒用途的細(xì)菌種子批，應(yīng)檢査質(zhì)粒產(chǎn)率。對(duì)于引入的治療基因，應(yīng)檢測(cè)其表達(dá)水平和功能活性。對(duì)于減毒細(xì)菌載體，應(yīng)鑒定其減毒的特性和穩(wěn)定性，并檢測(cè)其對(duì)抗生素的敏感性。

2.3.4 質(zhì)粒DNA

對(duì)用于瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)粒DNA,需對(duì)其來(lái)源、特性、分離純化方法以及核酸序列等進(jìn)行描述,對(duì)質(zhì)粒DNA的復(fù)制起始點(diǎn)、啟動(dòng)子以及編碼選擇性標(biāo)記的基因等組成元件的來(lái)源和功能進(jìn)行說(shuō)明。質(zhì)粒的生產(chǎn)應(yīng)基于細(xì)菌種子批系統(tǒng)，并符合相關(guān)要求。應(yīng)采用適宜的方法純化質(zhì)粒，并基于風(fēng)險(xiǎn)分析和產(chǎn)品特性對(duì)每批質(zhì)粒的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，通常包括鑒別、基因組完整性、質(zhì)粒含量、質(zhì)粒純度、宿主細(xì)胞DNA殘留量、質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率或其他可反腫轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)項(xiàng)目，如細(xì)菌內(nèi)毒表檢育和無(wú)菌檢音等，檢測(cè)結(jié)果符合要求后才能用干載體的生產(chǎn),

2.4 原材料及輔料

生產(chǎn)過(guò)程中所使用的原材料及輔料應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料質(zhì)量控制"的相關(guān)要求。對(duì)可能影響制品安全性的相關(guān)原材料(或渚如輔助病毒/包裝序列或介質(zhì)等原材料的組成部分)，應(yīng)評(píng)估其在最終制品或工藝最適階段中的殘留情況，并根據(jù)具體情況確定其殘留限度。

輔助病毒涉及病毒種子批系統(tǒng)的設(shè)計(jì)、構(gòu)建、生產(chǎn)和使用等應(yīng)符合2.3.1項(xiàng)相關(guān)要求。

來(lái)源干動(dòng)物組織或體液的原材料應(yīng)嚴(yán)格控制外源因子污染的安全性風(fēng)險(xiǎn)。生產(chǎn)過(guò)程中不得使用青霉素等8-內(nèi)酰胺類抗生素和鏈蛋素,以及其他如溴化乙錠等有毒試劑。

用作病毒或DNA載體遞送系統(tǒng)的復(fù)合材料必須符合其預(yù)期目的，并具有良好的工藝穩(wěn)定性和產(chǎn)品穩(wěn)定性。應(yīng)根據(jù)其具體性質(zhì)和對(duì)制品的影響情況進(jìn)行適當(dāng)鑒定，并建立相應(yīng)的檢測(cè)方法和質(zhì)控要求。

生產(chǎn)過(guò)程的控制

生產(chǎn)工藝應(yīng)穩(wěn)定可靠，并有明確的過(guò)程控制參數(shù)，以確保制品安全、有效和全程質(zhì)量可控。生產(chǎn)工藝的確定應(yīng)建立在對(duì)目標(biāo)制品的質(zhì)量屬性、生產(chǎn)工藝的深入理解和全面設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上。應(yīng)根據(jù)研發(fā)早期到規(guī)?；a(chǎn)的整個(gè)工藝周期的相關(guān)信息,確定原液和成品生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟，并依據(jù)制品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，確定工藝參數(shù)和過(guò)程控制項(xiàng)目，并制定相應(yīng)可接受標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制，以確保工藝過(guò)程的重現(xiàn)性及制品質(zhì)量的批間一致性。

2.5.1 病毒/細(xì)菌培養(yǎng)物的制備

2.5.1.1 病毒培養(yǎng)物的制備

(1)細(xì)胞培養(yǎng) 將工作細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞按規(guī)定傳代,同一種病毒生產(chǎn)用的細(xì)胞擴(kuò)增應(yīng)盡可能按相同的消化程序、分種擴(kuò)增比率、培養(yǎng)時(shí)間及培養(yǎng)條件進(jìn)行傳代。在病毒種子或產(chǎn)品的外源病毒因子檢育因制品病毒不能被充分中和而受到干擾等情況下,應(yīng)在生產(chǎn)中設(shè)置對(duì)照細(xì)胞,對(duì)照細(xì)胞的外源病毒因子檢査應(yīng)符合本版藥典的要求。采用生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)的應(yīng)按固定的放大模式擴(kuò)增，并建立與生物反應(yīng)器培養(yǎng)相適應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞外源因子檢查。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中需監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，并根據(jù)生產(chǎn)系統(tǒng)的特點(diǎn)確定監(jiān)測(cè)頻率及指標(biāo)。

(2)病毒增殖和收獲 接種病毒時(shí)應(yīng)明確病毒感染性滴度與細(xì)胞的最適比例,同一工作種子批按同一MOI接種，采用多質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或加入輔助病毒等生產(chǎn)病毒的方式，也應(yīng)明確加入量與細(xì)胞的最適比例。

應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)過(guò)程中培養(yǎng)、增殖和產(chǎn)物產(chǎn)量一致性的研究資料，確定終止培養(yǎng)、收獲產(chǎn)物的技術(shù)參數(shù)。每次收獲后應(yīng)檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物含量、細(xì)菌內(nèi)毒素支原體等。應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)過(guò)程及所用材料的特點(diǎn)，在適宜的階段進(jìn)行常規(guī)或特定的外源病毒污染檢查。

來(lái)源于同一細(xì)胞批的單次病毒收獲液經(jīng)檢驗(yàn)合格可合并進(jìn)行純化。多次收獲的病毒培養(yǎng)液,如單一培養(yǎng)容器出現(xiàn)污染,則與該污染容器相關(guān)的病毒收獲液均不得用于生產(chǎn)。

2.5.1.2 細(xì)菌培養(yǎng)物的制備

(1)細(xì)菌培養(yǎng) 將工作種子接種于規(guī)定的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。自菌種開啟到菌體收獲應(yīng)有明確的擴(kuò)增次數(shù)規(guī)定。細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中可進(jìn)行細(xì)菌純度細(xì)菌總數(shù)、DH值及耗氧量等監(jiān)測(cè)。

(2)菌體的收獲 根據(jù)不同的培養(yǎng)方式采用適宜的方法收獲菌體。培養(yǎng)物收獲后應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌純度、細(xì)菌總數(shù)、活菌含量等檢測(cè)。

2.5.2提取和純化

采用的分離純化方法或技術(shù)，應(yīng)能適應(yīng)于規(guī)?；a(chǎn)并保持穩(wěn)定。應(yīng)對(duì)純化工藝中可能殘存的有害物質(zhì)進(jìn)行嚴(yán)格控制，包括固定相或流動(dòng)相中的化學(xué)試劑、各類親和色譜柱的脫落配基或抗體以及可能對(duì)目標(biāo)制品關(guān)鍵質(zhì)量屬性造成影響的各種物質(zhì)等。

純化工藝應(yīng)保證將制品的一些特定工藝雜質(zhì)去除或降低至可接受的水平,包括來(lái)自表達(dá)載體的核酸、宿主細(xì)胞DNA、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、污染的外源醫(yī)子、細(xì)菌內(nèi)毒素、核酸酶以及源自培養(yǎng)液的各種其他殘留物等。

2.5.3 原液

收獲液經(jīng)提取、純化后分裝于中間貯存容器中即為原液。如需加入穩(wěn)定劑或賦形劑，應(yīng)不影響質(zhì)量檢定，否則應(yīng)在添加輔料前取樣進(jìn)行原液檢定。原液的檢測(cè)項(xiàng)目取決于工藝的驗(yàn)證,一致性的確認(rèn)以及預(yù)期的制品相關(guān)雜質(zhì)與工藝相關(guān)雜質(zhì)水平。應(yīng)采用適當(dāng)方法對(duì)原液質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，必要時(shí)應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行比較。原液如需貯存，應(yīng)通過(guò)制品穩(wěn)定性驗(yàn)證確定貯存條件和時(shí)間

2.5.4 復(fù)合工藝控制

對(duì)于復(fù)合的基因治療制品(如載體或基因構(gòu)建體與高分子聚合物、聚陽(yáng)離子、納米材料、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等形成復(fù)合物或相連接)，其復(fù)合材料的生產(chǎn)以及復(fù)合的過(guò)程應(yīng)根據(jù)具體的產(chǎn)品情況和工藝特點(diǎn)設(shè)置適宜的工藝參數(shù)和過(guò)程控制要求，以保持工藝穩(wěn)定性和產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。

2.5.5 半成品

除另有規(guī)定外，制備成品前，如需對(duì)原液進(jìn)行稀釋或加入其他輔料制成半成品，應(yīng)確定半成品的質(zhì)量控制要求，包括檢定項(xiàng)目和可接受的標(biāo)準(zhǔn)

2.5.6 成品制劑

制劑生產(chǎn)應(yīng)符合本版藥典和中國(guó)現(xiàn)行《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的相關(guān)要求。

2.5.7 包裝及密閉容器系統(tǒng)

直接應(yīng)用于人體的基因治療制品原液和成品與容器的相容性應(yīng)符合相關(guān)要求。此外，應(yīng)采用適宜方法對(duì)容器完整性進(jìn)行檢測(cè)，防止容器泄漏導(dǎo)致制品無(wú)菌狀態(tài)的破壞。

2.6 生產(chǎn)工藝變更

生產(chǎn)工藝變更應(yīng)符合國(guó)家藥品注冊(cè)管理等相關(guān)要求。涉及重大生產(chǎn)工藝的變更,應(yīng)對(duì)變更前后的制品質(zhì)量、安全性和有效性進(jìn)行比較和評(píng)估，以證明變更前后制品特性的高度相似，并確保任何質(zhì)量屬性方面的改變對(duì)制品安全和有效性無(wú)負(fù)面影響。

3特性分析

應(yīng)采用先進(jìn)的分析手段，從生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、物理化學(xué)等角度,對(duì)人用基因治療制品的基因型和表型、純度、治療序列活性/生物效價(jià)、感染性/轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和預(yù)期用途的適用性等進(jìn)行全面的分析，并提供盡可能詳細(xì)的信息，以反映目標(biāo)制品內(nèi)在的質(zhì)量屬性，并作為建立和制定上市制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)。特性分析應(yīng)包括對(duì)原材料、中間體、原液和成品特性的分析。對(duì)于復(fù)合核酸載體，應(yīng)充分研究載體、復(fù)合組分和復(fù)合物的特性。特性分析數(shù)據(jù)可能來(lái)自整個(gè)開發(fā)和(或)制造過(guò)程。對(duì)于不同階段(開發(fā)、試生產(chǎn)、完整規(guī)模生產(chǎn)等)生產(chǎn)的產(chǎn)品批次可根據(jù)不同情況開展適宜程度的特性分析研究，其中用于制定上市制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品批次工藝應(yīng)代表預(yù)期的上市制品工藝。

特性分析一般在研發(fā)階段進(jìn)行，并通過(guò)生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，以及具有代表性的足夠批次制品的周期性監(jiān)測(cè)加以完善特性分析至少應(yīng)包括以下內(nèi)容。

結(jié)構(gòu)分析3.1

應(yīng)對(duì)治療序列的選擇/調(diào)節(jié)/控制作用涉及的基因完整序列進(jìn)行分析，并進(jìn)行適宜的限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析,以補(bǔ)充鑒定轉(zhuǎn)錄/翻譯元件和開放閱讀框以及其余載體序列。應(yīng)檢測(cè)重組載體基因組或質(zhì)粒的完整性和均一性,進(jìn)行載體遞送的治療序列和選擇/調(diào)節(jié)元件的表型鑒別和分析。對(duì)干病毒載體，適當(dāng)情況下應(yīng)測(cè)定插入位點(diǎn)，并充分評(píng)估插入突變的可能性和相關(guān)風(fēng)險(xiǎn);對(duì)于質(zhì)粒，應(yīng)確認(rèn)復(fù)制起點(diǎn)的位置以及是否存在CpG序列(如果與制品的設(shè)計(jì)相關(guān));對(duì)于細(xì)菌載體，應(yīng)確認(rèn)是否存在涉及制品安全性的插入/刪除序列;對(duì)于轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)菌載體，應(yīng)檢測(cè)質(zhì)粒和相關(guān)調(diào)控/控制元件的存在及序列。

3.2生物學(xué)活性

應(yīng)依據(jù)制品的作用機(jī)制，盡可能確定與療效最為相關(guān)的質(zhì)量屬性,并建立相應(yīng)的檢測(cè)方法。應(yīng)證明替代、補(bǔ)償、阻斷、修正特定基因的預(yù)期作用，對(duì)于含有多種活性成分的制品，需要分別建立方法對(duì)各個(gè)成分的活性進(jìn)行測(cè)定,同時(shí)還應(yīng)考慮活性成分之間可能存在的干擾或協(xié)同等作用。在相關(guān)細(xì)胞類型中分析載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和/或拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平、相關(guān)生物活性以及與載體或遞送系統(tǒng)的作用機(jī)制相關(guān)的因素。應(yīng)分析預(yù)期的病毒載體的宿主范圍和組織嗜性，或復(fù)合核酸遞送的選擇性，以及轉(zhuǎn)基因表達(dá)的選擇性。

3.3 純度、雜質(zhì)和污染物

人用基因治療制品雜質(zhì)主要包括工藝相關(guān)雜質(zhì)、制品相關(guān)雜質(zhì)以及外源污染物。應(yīng)盡可能地對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行分析鑒定，并采用適宜的方法評(píng)估其對(duì)生物學(xué)活性和安全性的影響。在復(fù)合核酸的情況下，應(yīng)考慮到復(fù)合物合成和生產(chǎn)所產(chǎn)生的副產(chǎn)品/雜質(zhì)對(duì)復(fù)合物的安全性和性能的影響。

3.3.1 工藝相關(guān)雜質(zhì)

工藝相關(guān)雜質(zhì)來(lái)源于生產(chǎn)工藝本身，主要包括起始原材料來(lái)源(如殘留宿主細(xì)胞DNA和殘留宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)等)原材料來(lái)源(如培養(yǎng)試劑、純化試劑、輔助病毒和輔助病毒核酸等)和設(shè)備材料來(lái)源(如工藝中的可漫出物和可提取物、色譜填料脫落物等)的雜質(zhì),應(yīng)對(duì)潛在的工藝相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行鑒定、評(píng)估，并進(jìn)行定性和/或定量分析，

3.3.2 制品相關(guān)雜質(zhì)

應(yīng)盡可能鑒定具有缺失、重排，雜交或突變序列的載體等制品相關(guān)雜質(zhì),如可行，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行定量。必要時(shí),應(yīng)對(duì)載體中可能存在的共包裝非目標(biāo)DNA序列進(jìn)行確認(rèn)。應(yīng)分析生產(chǎn)過(guò)程中潛在的載體降解情況，如測(cè)定非感染性載體、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率降低的質(zhì)粒，或核酸復(fù)合物經(jīng)過(guò)氧化或解聚等的降解形式。在設(shè)計(jì)為復(fù)制缺陷型或條件復(fù)制型載體的情況下，應(yīng)分析是否存在殘留的復(fù)制型或野生型載體及其水平

3.3.3 污染物

污染物系指所有引入日并非生產(chǎn)過(guò)程所需的物質(zhì)(如各種微生物、細(xì)菌內(nèi)毒素)。應(yīng)嚴(yán)格避免引入污染物并對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)控制。

3.4 含量

應(yīng)建立基因治療制品物理數(shù)量和生物數(shù)量的含量檢測(cè)指標(biāo)?？梢酝ㄟ^(guò)諸如總顆粒數(shù)、感染性滴度或感染性顆粒數(shù)、基因組DNA/RNA或質(zhì)粒DNA濃度等的檢測(cè)來(lái)確定含量?？赏ㄟ^(guò)物理、生物物理等方法來(lái)測(cè)量顆粒的物理數(shù)量，或測(cè)量病毒顆粒內(nèi)已知分子量和拷貝數(shù)的某種代表性的結(jié)構(gòu)蛋白來(lái)評(píng)估病毒顆粒數(shù)。感染性滴度或感染性顆粒數(shù)可采用噬斑形成單位(PFU)、半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)等基于細(xì)胞的體外檢測(cè)方法。對(duì)于病毒載體，應(yīng)控制總顆粒數(shù)或基因組拷貝數(shù)等物理數(shù)量與感染性滴度或感染性顆粒數(shù)的比例。應(yīng)盡可能使用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌穪?lái)校準(zhǔn)含量測(cè)定結(jié)果。通過(guò)方法學(xué)研究確定用于制品放行檢定的含量測(cè)定方法。

3.5 其他特性

通常應(yīng)評(píng)估顆粒或分子大小的平均值和分布、聚集體以及折射率等多種理化和其他特性及其與制品安全、有效性的關(guān)系，必要時(shí)應(yīng)將其納入制品檢定項(xiàng)目中。

病毒載體類基因治療制品，還應(yīng)對(duì)病毒的感染性、毒力、復(fù)制能力等特性進(jìn)行分析。應(yīng)分析載體脫落、載體復(fù)制、插入突變、內(nèi)源性病毒再激活或與內(nèi)源性病毒互補(bǔ)的可能性，以及對(duì)安全性的影響。

復(fù)合核酸類基因治療制品，其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)以及載體和帶負(fù)電荷的DNA之間的相互作用可能影響制品的安全性和有效性，應(yīng)充分鑒定復(fù)臺(tái)/遞送系統(tǒng)的性質(zhì)，包括結(jié)構(gòu)形式、粒度分布、表面電荷、在特定情況和生物環(huán)境中的穩(wěn)定性,以及復(fù)合結(jié)構(gòu)內(nèi)的核酸分布，通過(guò)特性研究確定的與關(guān)鍵質(zhì)量屬性相關(guān)的特性，如對(duì)預(yù)期用途有重要影響的復(fù)合核酸的生物化學(xué)和生物學(xué)特性，應(yīng)建立適宜的方法并納入制品放行檢定項(xiàng)目。

細(xì)菌載體類基因治療制品，應(yīng)測(cè)定其質(zhì)粒拷貝數(shù)和含/不含質(zhì)粒細(xì)菌的比例。應(yīng)分析表型、免疫學(xué)特性(包括選傳修飾的細(xì)菌成分)以及由細(xì)菌載體遞送的治療序列和選擇/調(diào)控元件等。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)4

對(duì)于效價(jià)、感染性滴度等活性檢測(cè)方法，應(yīng)建立具有長(zhǎng)期穩(wěn)定性的活性標(biāo)準(zhǔn)品/參考品。對(duì)于鑒別試驗(yàn)、顆粒數(shù)等各種理化分析，可選擇已證明足夠穩(wěn)定目適合臨床試驗(yàn)的一個(gè)(多個(gè))批次，或用一個(gè)代表批次作為參考品/對(duì)照品，并應(yīng)按特性分析要求進(jìn)行分析鑒定。在采用PCR或定量PCR方法的檢定項(xiàng)目中所用到的質(zhì)粒DNA或核酸對(duì)照品，在制備和分裝后應(yīng)進(jìn)行適官的分析定標(biāo)準(zhǔn)品/參考品/對(duì)照品的建立和制備可參照"生物制品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備和標(biāo)定"的相關(guān)要求。

5制品檢定

應(yīng)根據(jù)制品關(guān)鍵質(zhì)量屬性、對(duì)制品和工藝的深入了解和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的原則,制定相應(yīng)質(zhì)量控制策略。制品檢定采用的檢測(cè)方法應(yīng)經(jīng)驗(yàn)證或確認(rèn)并符合要求。納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢定項(xiàng)目、可接受限度，應(yīng)結(jié)合特性分析數(shù)據(jù)、臨床前和(或)臨床研究多批次樣品的數(shù)據(jù)、工藝驗(yàn)證批次的數(shù)據(jù)、穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)等綜合確定?；蛑委熤破返馁|(zhì)量檢定至少應(yīng)包括以下項(xiàng)目，但對(duì)不同的制品和生產(chǎn)工藝還需結(jié)合具體情況加以考慮。

5.1鑒別試驗(yàn)

根據(jù)人用基因治療制品的情況，應(yīng)在核酸序列水平采用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析、PCR、RT-PCR和核酸序列測(cè)定等方法對(duì)載體組成、治療序列、缺失片段以及其他影響治療序列表達(dá)的重要部分進(jìn)行鑒定;同時(shí)在蛋白質(zhì)水平采用蛋白質(zhì)電泳、免疫印跡、免疫中和試驗(yàn)等方法，對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白、表達(dá)產(chǎn)物、免疫標(biāo)記、表型特征等進(jìn)行鑒別。對(duì)于復(fù)合的核酸制品，應(yīng)對(duì)相應(yīng)的脂質(zhì)等復(fù)合成分進(jìn)行鑒別試驗(yàn)。鑒別試驗(yàn)應(yīng)設(shè)置適宜的陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

5.2純度和雜質(zhì)

應(yīng)采用類似正交組合的方法來(lái)評(píng)估制品的純度/雜質(zhì)，

5.2.1 總純度

適用的情況下，應(yīng)采用HPLC、SDS-PAGE、紫外吸收(如Az60/A28o比值測(cè)定)等方法評(píng)估產(chǎn)品的總純度水平

5.2.2 工藝相關(guān)雜質(zhì)

對(duì)于工藝相關(guān)雜質(zhì)，應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞來(lái)源的污染物的殘留水平,例如來(lái)自包裝細(xì)胞系或細(xì)菌的宿主細(xì)胞蛋白和宿主細(xì)胞DNA。對(duì)于生產(chǎn)中使用了輔助病毒、質(zhì)粒DNA、牛血清、核酸酶、抗生素等的制品,還應(yīng)分別檢測(cè)其殘留量或殘留活件。如在生產(chǎn)中使用了其他對(duì)人體有害的試劑,如有機(jī)溶劑等也應(yīng)在制品中進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)。生產(chǎn)過(guò)程如使用致瘤細(xì)胞系，殘留DNA水平應(yīng)嚴(yán)格控制并保持在最低水平。經(jīng)充分驗(yàn)證證明生產(chǎn)工藝對(duì)工藝相關(guān)雜質(zhì)已有效控制或去除，并達(dá)到可接受的水平，相關(guān)殘留物的檢定項(xiàng)目可不列入成品的常規(guī)放行檢定中。

5.2.3 制品相關(guān)雜質(zhì)

對(duì)制品相關(guān)雜質(zhì)的檢測(cè)包括非功能形式的載體、共包裝的無(wú)用基因序列等。例如，在可能的情況下，應(yīng)控制病毒載體的空殼粒數(shù)和聚集體，對(duì)于質(zhì)粒DNA，應(yīng)控制不同質(zhì)粒形式的比例等。采用復(fù)制缺陷型或條件復(fù)制型病毒載體時(shí)，應(yīng)對(duì)復(fù)制型病毒或野生型病毒進(jìn)行檢測(cè)，且殘留水平應(yīng)控制在一定限度，限度標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)依據(jù)制品的非臨床和(或)臨床數(shù)據(jù)確定;明確具有較大臨床安全性風(fēng)險(xiǎn)的，應(yīng)證明制品中不存在復(fù)制型病毒或野生型病毒。

效價(jià)3

根據(jù)制品特性，應(yīng)至少建立一個(gè)反映療效的生物效價(jià)指標(biāo)。效價(jià)測(cè)定通常包括對(duì)基因轉(zhuǎn)移效率(感染性/轉(zhuǎn)導(dǎo)效率/傳遞效率)、治療序列表達(dá)的水平、表達(dá)產(chǎn)物的功能或整個(gè)制品的直接活性(例如腫瘤細(xì)胞殺傷活性等)的測(cè)定。效價(jià)測(cè)定應(yīng)盡可能采用定量的方法;首選體外生物效價(jià)檢測(cè)方法如體外感染、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)易感細(xì)胞后，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的功能測(cè)定(如測(cè)定酶活性、細(xì)胞牛長(zhǎng)的刺激或抑制等)。當(dāng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的牛物學(xué)功能表現(xiàn)出的法性范圍過(guò)寬或僅能產(chǎn)生半定量甚至僅為定性結(jié)果時(shí),可采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELSA)或其他定量方法測(cè)定治療序列的表達(dá)水平,作為補(bǔ)充的效價(jià)測(cè)定方法。體外方法不可行時(shí)，可采用動(dòng)物離體組織或動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)方法，必要時(shí)可采用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或移植了人體組織或系統(tǒng)的動(dòng)物。效價(jià)測(cè)定需要采用相應(yīng)的活性標(biāo)準(zhǔn)品或參比品，用于計(jì)算供試品的相對(duì)效價(jià)或作為對(duì)照。

5.4 含量

根據(jù)制品組成情況，應(yīng)對(duì)總顆粒數(shù)、感染性滴度或感染性顆粒數(shù)、基因組DNA/RNA或質(zhì)粒DNA的量或濃度進(jìn)行適宜的組合來(lái)測(cè)定原液和成品的含量，并用標(biāo)準(zhǔn)品/參考品進(jìn)行比較計(jì)算或作為對(duì)照。在制品為病毒載體的情況下,還應(yīng)進(jìn)行總顆粒數(shù)或基因組拷貝數(shù)等物理數(shù)量與感染性滴度比例的測(cè)定和控制。

股安全性試驗(yàn)

根據(jù)制品特性而定，應(yīng)至少包括無(wú)菌檢査、細(xì)菌內(nèi)毒素檢査、異常毒性檢查等,

5.6 其他檢測(cè)項(xiàng)目

應(yīng)根據(jù)相關(guān)制品的特性和劑型而定。檢測(cè)應(yīng)包括但不限于外觀(例如性狀、顏色)、澄清度、可見(jiàn)異物、不溶性微粒、pH值、滲透壓摩爾濃度、裝量、水分、賦形劑、粒度和粒度分布、乳光、折射率、zeta電位、包封率、釋放效應(yīng)等。

6貯存、有效期和標(biāo)簽

制品貯存應(yīng)符合”生物制品分包裝及貯運(yùn)管理”規(guī)定，成品應(yīng)在適合的環(huán)境條件下貯存和運(yùn)輸。自生產(chǎn)之日起，按批準(zhǔn)的有效期執(zhí)行。標(biāo)簽應(yīng)符合“生物制品分包裝及貯運(yùn)管理”要求和國(guó)家相關(guān)規(guī)定，標(biāo)示內(nèi)容至少應(yīng)包括:

(1)制品名稱;

(2)每瓶的活性單位(如必要);

(3)每瓶有效成分含量;

(4)每瓶標(biāo)示體積(液體制劑);

(5)批號(hào)和有效期

來(lái)源：藥典委